從浙江、上海、江蘇、山東、河南、廣西采集了26份表現(xiàn)雙生病毒癥狀的番茄樣品,利用雙生病毒簡并引物PA/PB擴增得到約500 bp的特異片段,經(jīng)克隆測序確定所得番茄樣品均感染雙生病毒。在GenBank上比對分析表明,共檢測到三種不同的病毒,即番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、臺灣番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl Taiwan virus,ToLCTWV)以及中國番木瓜曲葉病毒(Papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV)。所有分離物都沒有發(fā)現(xiàn)伴隨有衛(wèi)星DNAβ分子或DNA B組份。對浙江、江蘇及山東的TYLCV分離物進行了全序列測定,結(jié)果表明各地分離到的TYLCV分離物具有很高的序列同源性(＞98%),與TYLCV-IL[IL:Reo](X15656)的序列同源性均大于97%。通過對GenBank上TYLCV代表分離物全序列進行系統(tǒng)進化樹分析,表明不同分離物之間序列同源性非常高,但是仍可以分為兩大類群。其中侵染我國番茄的雙生病毒分離物都屬于第一類。對廣西及河南的PaLCuCNV分離物進行了金序列測定,全序列長分別為2748(HeNZM1,FN256260)和2738(GX4,FN297834)nt。它們與PaLCuCNV-[CN:G2](AJ558123)的同源性為94.6%和89.3%,因此被命名為PaLCuCNV-[CN:HeNZM1]和PaLCuCNV-[cN:GX4]。在浙江溫州的番茄樣品中鑒定到了臺灣番茄曲葉病毒(ToLCTWV),對ZJWZ5分離物進行了全序列克隆測序(2748 nt,FN256292)。它與ToLCTWV-[CN:ZJ16]分離物(AM698111)的同源性為99%,因此被命名為ToLCTWV-[CN:WZ5]。構(gòu)建了侵染番茄的三類雙生病毒(TYLCV、PaLCuCNV和ToLCTWV)的侵染性克隆,致病性測定表明,TYLCV-[CN:SH2]和PaLCuCNV-[CN:HeNZM1]侵染性克隆均可系統(tǒng)侵染本氏煙、三生煙、心葉煙、番茄、矮牽牛并表現(xiàn)明顯癥狀,但不能侵染黃瓜、棉花、茄子及辣椒。此外,發(fā)現(xiàn)TYLCV能夠與異源的DNAβ互作且誘導(dǎo)比病毒單獨侵染更嚴(yán)重的癥狀。ToLCTWV-[CN:ZJ16]侵染性克隆能侵染番茄并產(chǎn)生葉片卷曲癥狀,但不能侵染本氏煙、三生煙及矮牽牛。當(dāng)ToLCTWV-[CN:ZJ16]與異源的DNAβ共同接種時,發(fā)現(xiàn)除了在番茄上產(chǎn)生更嚴(yán)重的癥狀外,還能夠侵染本氏煙、三生煙及矮牽牛并產(chǎn)生嚴(yán)重的癥狀。搜集了20個抗雙生病毒的番茄抗性材料,利用已經(jīng)報道的分子標(biāo)記,初步分析這些材料攜帶抗病基因Ty-1、Ty-2和Ty-3。用TYLCV侵染性克隆對抗性材料進行抗性篩選,發(fā)現(xiàn)TYLCV接種后這些抗性材料的抗性表現(xiàn)差異很大,發(fā)病率與病毒含量并不相關(guān)。用生物信息學(xué)軟件對侵染我國番茄的TYLCV、TYLCCNV、ToLCCNV、ToLCTWV、PaLCuCNV、TbCSV和TYLCTHV等雙生病毒的基因組全序列進行了分析,選取三個保守區(qū)段并將其融合作為沉默的靶基因,構(gòu)建植物表達(dá)載體pBin438-hp。將該載體轉(zhuǎn)化番茄并獲得轉(zhuǎn)基因植株,經(jīng)PCR驗證得到34株轉(zhuǎn)基因番茄植株,對病毒的抗性正在測定中。
